高密度细胞培养的单次使用澄清系统

 尽管单次使用已非全新的理念，并且在囊式过滤器和贮存袋之类的产品中已经成为标准操作，当下单次使用工艺比常规的生产方法更为复杂，由集成模块构成——尤其是在新设备中——通常替代了原来的不锈钢设备。 

目前单次使用技术被*是可以减少交叉污染的风险，降低投资风险，具备更大的灵活性，可以为试验用药品提供具有成本效益的产品开发方案。单次使用生物反应器问世尚未超过20 年，考虑到诸如此类的因素，可以认为这种技术在如此短的时间之内呈现出迅猛发展，推陈出新的发展态势。 

当前，得益于单克隆抗体（mAb）生产领域中菌株的优化和培养基的改善，分批补料式哺乳动物细胞培养系统的生产效率已经显著提升。生物量浓度已经从1-3 g/L 增至7-10 g/L，因此促进了较小规模的生产容器的运用，不过与此同时，也让下游的工艺面临更多的难题。[1,2] 产量更大、浓度更高，深层过滤器难以进行处理。对大于500 L 的体积，要降低生产成本并减少浪费，离心机的使用。 

运用即用型澄清系统，高达2,000L 的体积都可实现单次使用处理，这样商业可行的方案，在一个步骤内就能替代离心机和深层过滤器。

 
图片由赛多利斯公司提供

收集技术 

高产品滴度源自于细胞密度的增加而非每一种细胞单位生产率的提升，所以固体量会明显增大，常规的收集技术难以应对。 

目前，泛应用的单次使用收集技术是深层过滤。不过，生物量浓度较高的情况下，深层过滤器在负载量较低时就会堵塞。较高的污染物浓度也让深层过滤器对批次变异更为敏感，因此为了弥补过滤能力的波动， 过滤器的面积会过大（ 多达50%）。目前可以使用离心之类的单次使用细胞去除方案，但是生产能力较低，导致成本较高，浪费较大。 

不过，一种新替代方案已经出现。赛多利斯斯泰迪生物技术公司的产品Sartoclear Dynamics 是一种新的单次使用技术，用于高细胞密度的动物细胞培养的收集。这种即用型的澄清系统得益于血浆成分分离行业的启发，以掺浆过滤（BFF）的理念作为基础，该系统性能稳定、易于使用、快速、可以灵活地放大。 

该系统可以处理高达2,000 L 的体积，因此能够在一个步骤之内同时替代离心机和深层过滤器。关键因素在于进料流中添加了高孔隙度的助滤剂，增加了滤饼的渗透性，防止过滤器出现堵塞。

掺浆过滤 

很长时间以来， 掺浆过滤中运用硅藻土（DE）之类的助滤剂来提升过滤器的性能。[3] 硅藻土（DE， 或称为diatomite 、kieselgur/kieselguhr） 是一种天然存在的硅质沉积岩，质软，通常粒径为10-200 μm。DE 是由硅藻（微小的单细胞藻类）化石的壳或外骨骼构成，具有高孔隙率的结构和惰性特征，通常在生物技术行业的收集阶段用于深层过滤器。加入到细胞培养基中的DE 具有双重作用：滤除亚微米的颗粒，并形成一个具有渗透性的滤饼，改善过滤器的处理量。这种细小的助滤剂颗粒形成无数微小通道，悬浮的杂质被截留，而澄清的液体可以不受阻碍地通过。 

BFF 的工作原理 

现在有众多产品的生产运用了BFF 系统，其中包括静脉注射免疫球蛋白（IVIG）、白蛋白和一些凝血因子，所基于的原理包括选择性pH 诱导沉淀、离子强度、添加乙醇以及温度的变化。[4-6] 沉淀物的去除采用的是DE 强化的深层过滤。 

实际操作过程中，需要进行澄清操作的生物工艺流体中固体的浓度过高时，流体将不能透过过滤器表面的滤饼（图1）。添加DE 之类的助滤剂之后，形成的滤饼更具渗透性，可以防止堵塞。所需DE 的量取决于颗粒的浓度。为了获得理想的结果并使用尽可能少的DE，建议对细胞培养液进行预处理。可以添加凝聚剂或者可以降低pH 值，从而形成聚集体，其体积大至不能进入滤饼层。这样，滤饼可以保持渗透性，而DE 与生物量的比例可以降低为1:4。

 
赛多利斯斯泰迪生物技术公司的产品Sartoclear Dynamics 是一种新的单次使用技术，用于高细胞密度的哺乳动物细胞的收集，该技术得益于血浆成分分离行业的启发，以掺浆过滤（BFF）的理念作为基础。（图片有赛多利斯公司提供）图1：加入硅藻土（左）的动态掺浆过滤和常规的过滤（右）。

DE 有各种级别，纯度和渗透性各异，适合不同的应用，而赛多利斯斯泰迪生物技术公司选择了Celpure C300 作为哺乳动物细胞培养操作中最合适的助滤剂。 

Celpure C300 特别针对制药领域设计，采用生产工艺制造，是一种高纯度的DE，具有更出色的操作稳定性。在多种培养基、介质和活力条件下进行的测试发现，的DE 浓度为细胞湿重（WCW）的40-50%，如果pH 降低至5，这一比例还可以减小至20-30%。 

低pH 值沉淀的优势 

对于微孔过滤和深层过滤之类的细胞去除技术，性能的差异可以归结于低pH 值水平（pH 4.3-5.5）下较小颗粒的沉降。[4-5] 细胞碎片、DNA 以及宿主细胞蛋白在酸性条件下的溶解性都会降低。6 另外，降低pH 值之后可以形成较大的颗粒，原来在pH 7.0 时存在的亚微颗粒会*消失（图2）。与此类似，较低的pH 值也有利于BFF 的操作：所测试的细胞培养上清液在酸性条件下时，滤出液比中性条件时更为澄清（未显示数据）。

 
图2：三种不同的收集方式（绿色=pH 7.0，红色=pH 5.0，）下，不含细胞的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养上清液的平均粒径分布。利用Mastersizer 2000（Malvern Instruments 公司）记录数据。

人们认为，DE 可以捕获大颗粒（>0.4μm），因此总体的渗透性和过滤能力会降低。通过增加DE 的浓度，有可能改善其性能，截留小颗粒，同时不会丧失所需的滤饼渗透性。另外，虽然大部分抗体在酸性条件下是稳定的，但是有一些抗体可能会出现共沉淀。[5-6] 实验室的BFF 测试在低pH 值条件时，可以获得85% 以上的回收率（未显示数据）。 

实际应用 

细胞培养收集过程中BFF 已经作为一种替代方法得到广泛应用，因此赛多利斯斯泰迪生物技术公司与RentschlerBiotechnologie 公司合作，评估这种技术作为单次使用技术，替代离心机和深层过滤器的可能性。[7] 测试中采用了600 L 的细胞培养生产过程，对条件进行了优化，评估了BFF 技术的升级放大。 

Sartoclear Dynamics 是专门针对药品生产过程中哺乳动物细胞培养的澄清操作而设计的产品，利用这种设备在一系列细胞株和培养介质中获得了测试结果。 

运用高细胞密度的中国仓鼠卵巢（CHO） 细胞分批补料式培养（17.6×106 cells/mL，95% 的活力，1000L），进行了试验生产测试。[8] 的BFF 测试为600 L，pH 5.0（WCW = 8%）。在放大试验中，在通用型不锈钢支架中使用了总过滤面积为1.61 m2的七个工艺放大模块。 

过滤器的过滤盒由两层聚乙烯过滤板组成，中间为DE 和生物量。600L的收集液中加入Cellpure C300 DE（12kg），预填充DE 袋通过无尘适配器与混合袋连接，迅速安全地转移DE。温和混匀5 分钟之后，DE 的粉末溶于细胞悬浮液中；另外，在过滤前，对所获得的混合物调节pH 至5.0，以140 rpm 的速度混合2 小时。 

图3 所示为操作过程中的压力增加情况。当压力值达到1.3 bar 时，过滤过程结束，初始收集液已经过滤。在整个过程中保持了大约为300 L/m2/h 的快速且稳定的流速，并且总体的处理能力达到了311L/m2。在过滤过程中，澄清的收集液流具有很低的浊度水平（5–8 NTU）。中和之后，最终的液体具有41 NTU 的浊度，这个数值相当高，可能的原因在于未能充分调节中和缓冲液的用量。 

在一项小规模的平行测试中，改良中和步骤之后可以防止浊度的增加。正在开发的一种即用型整合工艺模块，可以让pH 值的在线调节实现可控。例如，IgG1 的回收率目前为85%（图3），今后，通过优化中和步骤，改进过滤后冲洗，mAb 的回收率将有望进一步得到提升。在整个工艺过程内对宿主细胞蛋白质和DNA 之类的污染物进行了监控，在最终的液体内（缓冲液冲洗以及中和之后），这些污染物的浓度分别从841 和13.8 mg/ml 降低至629 和5.0 mg/ml。

 
图3：七个过滤器模块中，降低pH（5.0）的情况下DE 掺浆过滤试验放大的结果。左：过滤性能、压力（bar）、流量（L/m2）以及过滤过程中的浊度。右：IgG1 的回收，在初始收集液、无缓冲冲洗的收集液（液1）、有缓冲冲洗（液2）以及中和之后的收集液（液3）中进行测量。

实验结果 

BFF 的试运行试验证实了此前实验室中观察到的结果：DE 加入到初始的细胞培养上清液之后，将pH 降低至5.0，这样的条件之下在过滤性能、冲洗和污染物去除方面可以获得的结果。此外，只需运用七个过滤模块，就可以在1 小时之内对600L 的收集液进行处理。因为模块座可以容纳多达33 个的模块，可以预计，高达3,000L 的收集体积可以同时进行过滤。因此，运用这样的方法，在单次使用的大规模装置内，可以对初始的高密度细胞培养收集液实现高效的澄清操作。 

总结 

测试的目的是为了证实一种新颖的单次使用收集方法，对于高密度的哺乳动物细胞培养具有普遍的适用性，测试中采用了不同的细胞株和培养条件下的初始收集液，确定了DE 作为助滤剂的浓度。此外，在低pH 条件下，发现助滤剂的量可以减少50%。 

与沉淀过程结合使用时，研究中的单次使用澄清系统稳定可靠，无需再使用离心机，其结果稳定一致，该系统易于操作、快速、可以在线放大，可以将两步骤的细胞收集操作转变为高效的单步骤操作，节约了时间和资金。 

BFF 等类似可以实现放大的技术弥补了单次使用产品市场中的空白之一。当前单次使用生物反应器的标准体积设定为2000 L，如此庞大的体积，不再需要离心机来去除细胞，这对于生物制药行业而言是巨大的技术进步，构建了一个真正的单次使用过程，带来了的灵活性，显著地降低了资金投入。Sartoclear Dynamics 这种产品特别针对cGMP 工艺设计，由单次使用预填充袋组成，其中含有超纯级别的硅藻土，可以在0.5-10 kg 的范围内选择。无尘粉末转移装置配备有快速连接适配器，DE可以直接与细胞培养液混合。这种多孔的助滤剂可以防止过滤器堵塞，另外因为该系统内生物量和助滤剂一直保持稳定的比例，过滤器的性能则可以连续稳定且达到状态，用户因此受益。BFF能够以高流速对非常稠密的初始细胞收集液进行澄清操作，因此具有经济效益并且提升了生产力。