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REAGEN 卡那霉素试剂盒
1．概述
REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒是用于细胞裂解液、培养液、质粒等样本中卡那霉素残留的定量检测。该试剂盒有以下特点：
Ø 快速(10-40分钟)，多种样品的非有机溶剂的提取方法，高回收率(>80%)。
Ø 高灵敏度（0.2ppb）。
Ø 高重复性。
Ø 快速的ELISA检测方法（不考虑样本量的前提下只需不到1小时）。
2.试剂盒原理
REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品、酶标物以及抗体加入孔中，如果样品中含有药物，会与微孔板上的抗原竞争抗体，同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中卡那霉素的含量成反比。
3.试剂盒组成
已包被抗原的酶标板(Kanamycin-coated Plate)（可拆式） 1×96孔
标准液(Standards)（0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2ppb） 6×1.0mL
高标液1000ppb（Spiking） 1×1.0mL
一抗(Antibody #1) 1×6.0mL
HRP酶标二抗(HRP-Conjugated Ab#2) 1×6.0mL
10×样品稀释液（10×Sample diluent） 1×15mL
20×浓缩洗液(Wash Solution) 1×28mL
TMB底物(TMB Substrate) 1×12mL
终止液(Stop Buffer) 1×12mL
本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过1个月不使用试剂盒，请将标品、一抗和二抗放置-20℃或者冰冻保存。
4.检测限
| 检测物质 | 检测下限（ng/g） |
| 细胞裂解液/培养液/质粒 | 0.2 |
5.交叉反应
| 交叉反应物质 | 交叉反应率（％） |
| 卡那霉素(Kanamycin ) | 100 |
| 链霉素（Streptomycin） | < 0.1 |
| 双氢链霉素（Dihydrostreptomycin） | < 0.1 |
| 新霉素(Neomycin) | < 0.1 |
6.未提供的设备或材料
1) 酶标仪
2) 离心机
3) 漩涡振荡器
4) 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)
5) 多道移液器（50-300mL）
7.注意事项
实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。
1) 标准品中含有卡那霉素，请小心使用。
2) 不要使用过期的试剂盒。
3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
4) 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热或者蒸发。同样的，不
要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。
6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。
7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。
8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。
9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。
8.样品的准备
确保样品的正确保存，一般来说，样品在2-4只能保存1-2天，如果要保存更长时间，就要保存在-20冷冻保存，在用之前需要将冷冻的样品在室温下或冰箱内解冻。
准备1×样品稀释液:
1体积 10×样品稀释液加9体积蒸馏水稀释。
细胞裂解液/培养液/质粒
（1） 取200mL细胞裂解液等样本，涡流震荡混匀30秒；
（2） 4000×g离心5分钟；
（3） 每孔取50mL上清液来检测。
稀释倍数:1
9.检测步骤
注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。
1) 1x洗液的制备
1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合。
检测
以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
| 试剂 | 每个反应需要的体积 | 24次反应的体积 |
| 一抗 | 50 mL | 1.2mL |
| 酶标二抗 | 50 mL | 1.2mL |
| 工作洗液 | 1 mL | 24 mL |
| 终止液 | 100 mL | 2.4mL |
| 底物 | 100 mL | 2.4mL |
（（1）加入50mL的标准品于所设定的孔中；
（2） 加入50mL的样品于所设定的孔中；
（3） 按顺序在每孔中加入50mL HRP酶标二抗和50mL一抗，轻敲微孔板边缘混匀30秒；
（4） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；
（5） 洗板4次，每次应该加入250mL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干；
（6） 加入100mL的TMB底物；计时，轻敲微孔板边缘混匀30秒；
（7） 在室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟，加入100mL的终止液终止反应；
（8） 在450nm下读OD值 (读数前，最好用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。
10.结果计算
（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100
（2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。
（3） 从标准曲线上读取样品的浓度值（通用计算软件根据Log/Log标曲看线性和结果）。
以下曲线图是卡那霉素酶联免疫反应测试盒典型标准曲线
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