REAGEN 卡那霉素酶联免疫反应试剂盒
1.概述
REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒是用于细胞裂解液、培养液、质粒等样本中卡那霉素残留的定量检测。该试剂盒有以下特点:
Ø 快速(10-40分钟),多种样品的非有机溶剂的提取方法,高回收率(>80%)。
Ø 高灵敏度(0.2ppb)。
Ø 高重复性。
Ø 快速的ELISA检测方法(不考虑样本量的前提下只需不到1小时)。
2.试剂盒原理
REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理,抗原已经包被于微孔板上。分析时,样品、酶标物以及抗体加入孔中,如果样品中含有药物,会与微孔板上的抗原竞争抗体,同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物,底物的颜色显色强度与样品中卡那霉素的含量成反比。
3.试剂盒组成
已包被抗原的酶标板(Kanamycin-coated Plate)(可拆式) 1×96孔
标准液(Standards)(0,0.2,0.6,1.8,5.4,16.2ppb) 6×1.0mL
高标液1000ppb(Spiking) 1×1.0mL
一抗(Antibody #1) 1×6.0mL
HRP酶标二抗(HRP-Conjugated Ab#2) 1×6.0mL
10×样品稀释液(10×Sample diluent) 1×15mL
20×浓缩洗液(Wash Solution) 1×28mL
TMB底物(TMB Substrate) 1×12mL
终止液(Stop Buffer) 1×12mL
本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存,有效期为一年。如果超过1个月不使用试剂盒,请将标品、一抗和二抗放置-20℃或者冰冻保存。
4.检测限
检测物质 | 检测下限(ng/g) |
细胞裂解液/培养液/质粒 | 0.2 |
5.交叉反应
交叉反应物质 | 交叉反应率(%) |
卡那霉素(Kanamycin ) | 100 |
链霉素(Streptomycin) | < 0.1 |
双氢链霉素(Dihydrostreptomycin) | < 0.1 |
新霉素(Neomycin) | < 0.1 |
6.未提供的设备或材料
1) 酶标仪
2) 离心机
3) 漩涡振荡器
4) 移液器(10、20和100mL,1mL各一支)
5) 多道移液器(50-300mL)
7.注意事项
实验前请阅读以下文字,以保证获得最佳实验效果。
1) 标准品中含有卡那霉素,请小心使用。
2) 不要使用过期的试剂盒。
3) 不同批次的试剂盒不要混用,抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
4) 尽量保持室温20-25℃,避免在通风口操作防止温度过低,过热或者蒸发。同样的,不
要在阳光直射下实验,防止过热及蒸发。在孵育期间,如果工作台温度过低,应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
5) 水质量很重要,确保使用蒸馏或者去离子水。
6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时,吸嘴靠于微孔接近底部,并保持接触。
7) 孵育时间的计算越规范越好,保持添加标准品的一致性,先添加标准品后添加样品。
8) 从低浓度到高浓度地添加标准品,降低影响标准品曲线质量的风险。
9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中,冷藏保存。
8.样品的准备
确保样品的正确保存,一般来说,样品在2-4只能保存1-2天,如果要保存更长时间,就要保存在-20冷冻保存,在用之前需要将冷冻的样品在室温下或冰箱内解冻。
准备1×样品稀释液:
1体积 10×样品稀释液加9体积蒸馏水稀释。
细胞裂解液/培养液/质粒
(1) 取200mL细胞裂解液等样本,涡流震荡混匀30秒;
(2) 4000×g离心5分钟;
(3) 每孔取50mL上清液来检测。
稀释倍数:1
9.检测步骤
注意:试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时,确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂,所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量,不能将试剂倒回原来的瓶子中,处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。
1) 1x洗液的制备
1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合。
检测
以下为计算份量的表格,用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
试剂 | 每个反应需要的体积 | 24次反应的体积 |
一抗 | 50 mL | 1.2mL |
酶标二抗 | 50 mL | 1.2mL |
工作洗液 | 1 mL | 24 mL |
终止液 | 100 mL | 2.4mL |
底物 | 100 mL | 2.4mL |
(1)加入50mL的标准品于所设定的孔中;
(2) 加入50mL的样品于所设定的孔中;
(3) 按顺序在每孔中加入50mL HRP酶标二抗和50mL一抗,轻敲微孔板边缘混匀30秒;
(4) 室温(22.5±2.5)°C避光孵育30分钟;
(5) 洗板4次,每次应该加入250mL 1×洗液,最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干;
(6) 加入100mL的TMB底物;计时,轻敲微孔板边缘混匀30秒;
(7) 在室温(22.5±2.5)°C避光孵育15分钟,加入100mL的终止液终止反应;
(8) 在450nm下读OD值 (读数前,最好用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。
10.结果计算
(1) 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100
(2) 以相对吸光度值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线。
(3) 从标准曲线上读取样品的浓度值(通用计算软件根据Log/Log标曲看线性和结果)。
以下曲线图是卡那霉素酶联免疫反应测试盒典型标准曲线
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